引言:
膽汁酸是膽汁的主要功能成分，參與肝腸循環。肝膽疾病引起膽汁酸肝腸循環障礙，造成人體膽汁酸含量異常，而膽汁酸含量變化也會影響人體膽汁酸的合成和分泌。因此膽汁酸含量是衡量肝膽功能正常與否的重要標志物。
目前，膽汁酸檢測的主要應用場景為妊娠期肝內膽汁酸淤積癥（Intrahepatic Cholestasis of Pregnancy, ICP）的篩查。ICP是一種妊娠期特有的疾病，多發生在妊娠中、晚期，發病率為0.8%-12%，主要危害胎兒，引起胎兒窘迫、早產、死胎、死產，使圍產兒患病率及死亡率明顯增加，是導致圍產兒病死率升高的主要原因之一。
膽汁酸分析方法主要包括GC法、GC-MS法、HPLC法和LC-MS/MS法。臨床上針對15種膽汁酸主要使用LC-MS/MS法進行分析測定，該方法簡便、靈敏，特異性好。因此，本方法采用ANYEEP TQ9100液相色譜串聯質譜系統，測定人血清中膽酸（CA）、甘氨膽酸（GCA）、?；悄懰幔?/span>TCA）、脫氧膽酸（DCA）、甘氨脫氧膽酸（GDCA）、牛磺脫氧膽酸（TDCA）、鵝脫氧膽酸（CDCA）、甘氨鵝脫氧膽酸（GCDCA）、?；蛆Z脫氧膽酸（TCDCA）、熊脫氧膽酸（UDCA）、甘氨熊脫氧膽酸（GUDCA）、?；切苊撗跄懰幔?/span>TUDCA）、石膽酸（LCA）、甘氨石膽酸（GLCA）、牛石氧膽酸（TLCA）。
實驗部分:
樣品處理：取待測樣本100μL，加入20μL內標，380μL乙腈，渦旋混勻并離心（4℃，15000rpm，5min）；取上清液400μL于96孔板中，40℃氮吹至干；加入100μL復溶液（50%乙腈），置于微孔板震蕩儀上1200rpm/min震搖5min，4000rpm離心5min，5μL進樣。
色譜條件：色譜柱使用Agilent Poroshell 120 EC C18 column 2.1mm×100mm 1.9μm進行液相分離，流動相A為水（含0.1%甲酸），流動相B為乙腈，柱溫40℃，梯度設置見表1。
質譜條件：采用電噴霧離子化源負離子（ESI-）模式和多反應監測模式（MRM）進行質譜掃描。離子化源溫度550℃，噴霧電壓-4500V，氣簾氣10psi，霧化氣50psi，輔助加熱氣55psi，碰撞氣8，EP -10V，CXP -8V。各化合物定量離子對參數見表2。
表1-梯度洗脫條件
| 時間 | 流速 | A組 | B組 |
| min | mL/min | % | % |
| 0 | 0.5 | 60 | 60 |
| 2 | 0.5 | 50 | 50 |
| 3.5 | 0.5 | 15 | 85 |
| 4 | 0.5 | 10 | 90 |
| 4.1 | 0.5 | 2 | 98 |
| 4.5 | 0.5 | 2 | 98 |
| 4.6 | 0.5 | 60 | 40 |
| 6 | 0.5 | 60 | 40 |
表2-15種膽汁酸及內標MRM離子對參數
| 待測物名稱 | Q1離子 | Q3離子 | 駐留時間 ms | DP (V) | CE (V) |
| CA | 407.3 | 407.3 | 30 | -200 | -35 |
| CA-d4 | 411.3 | 411.3 | 30 | -200 | -35 |
| DCA/CDCA | 391.31 | 391.31 | 30 | -200 | -35 |
| DCA/CDCA-d4 | 395.31 | 395.31 | 30 | -200 | -40 |
| UDCA | 391.3 | 391.3 | 30 | -200 | -5 |
| UDCA-d4 | 395.3 | 395.3 | 30 | -200 | -5 |
| LCA | 375.4 | 375.4 | 30 | -200 | -10 |
| LCA-d4 | 379.3 | 379.3 | 30 | -150 | -15 |
| GCA | 464.3 | 74.0 | 30 | -200 | -80 |
| GCA-d4 | 468.3 | 74.0 | 30 | -200 | -80 |
| GLCA | 432.4 | 74.1 | 30 | -150 | -80 |
| GLCA-d4 | 436.4 | 74.1 | 30 | -150 | -80 |
| GDCA/GCDCA/GUDCA | 448.4 | 74.0 | 30 | -150 | -80 |
| GCDCA/GUDCA-d4 | 452.4 | 74.0 | 30 | -150 | -80 |
| TCA | 514.3 | 80.1 | 30 | -200 | -80 |
| TCA-d4 | 518.3 | 80.0 | 30 | -200 | -80 |
| TDCA/TCDCA/TUDCA | 498.3 | 80.0 | 30 | -150 | -80 |
| TDCA/TCDCA/TUDCA-d4 | 502.3 | 80.0 | 30 | -150 | -80 |
| TLCA | 482.4 | 80.0 | 30 | -200 | -80 |
| TLCA-d4 | 486.4 | 80.0 | 30 | -200 | -80 |
結果與討論:
15種膽汁酸提取離子圖見圖1，保留時間、線性范圍、回歸方程（權重1/x2）、精密度（以RSD%計）和準確度（以回收率%計）見表3。
從表中可見，回歸方程r2均大于0.99（即r大于0.995），低濃度和高濃度的精密度（RSD%）均小于10%，回收率在92.2%-106.9%之間。
表3-15種膽汁酸保留時間、線性范圍、回歸方程、精密度和準確度結果
| 化合物 | 保留時間 min | 線性范圍 nM | 回歸方程 | 相關系數 r2 | RSD% | 回收率% |
| TUDCA | 0.972 | 2-200 | Y=0.012892X+0.011681 | 0.9935 | 5.2 | 106.2 |
| 5.0 | 104.3 | |||||
| TCA | 1.009 | 5-500 | Y=0.011281X+0.010229 | 0.9967 | 3.7 | 99.5 |
| 3.3 | 93.6 | |||||
| GUDCA | 1.384 | 25-2500 | Y=0.002581X+0.009855 | 0.9987 | 4.1 | 104.4 |
| 2.7 | 97.1 | |||||
| GCA | 1.402 | 40-4000 | Y=0.002141X+0.011291 | 0.9988 | 3.2 | 103.0 |
| 3.1 | 95.9 | |||||
| TCDCA | 1.421 | 20-2000 | Y=0.001623X+0.007608 | 0.9979 | 2.3 | 103.6 |
| 2.6 | 97.6 | |||||
| TDCA | 1.571 | 10-1000 | Y=0.002359X+0.083276 | 0.9998 | 5.4 | 100.7 |
| 2.3 | 98.5 | |||||
| CA | 2.170 | 5-500 | Y=0.008214X+0.008745 | 0.9940 | 3.9 | 106.9 |
| 3.2 | 96.1 | |||||
| GCDCA | 2.282 | 60-6000 | Y=0.001859X+0.008745 | 0.9988 | 3.8 | 106.6 |
| 2.9 | 98.4 | |||||
| UDCA | 2.301 | 5-500 | Y=0.037890X+0.118724 | 0.9971 | 8.1 | 101.6 |
| 4.5 | 92.2 | |||||
| GDCA | 2.507 | 60-6000 | Y=0.002012X-0.002509 | 0.9985 | 3.0 | 105.4 |
| 4.7 | 97.2 | |||||
| TLCA | 2.525 | 2-200 | Y=0.010689X+0.016102 | 0.9943 | 2.3 | 108.7 |
| 3.4 | 101.9 | |||||
| CDCA | 3.386 | 15-1500 | Y=0.025979X-0.033765 | 0.9915 | 6.9 | 106.1 |
| 8.2 | 97.2 | |||||
| DCA | 3.499 | 10-1000 | Y=0.012683X+0.043749 | 0.9969 | 4.1 | 104.9 |
| 6.0 | 97.9 | |||||
| GLCA | 3.555 | 5-500 | Y=0.007463X+0.002849 | 0.9990 | 3.0 | 104.8 |
| 5.0 | 95.9 | |||||
| LCA | 4.266 | 3-300 | Y=0.028897X+0.107925 | 0.9904 | 6.9 | 99.3 |
| 9.6 | 101.4 |
a,b 上行數據為低濃度，下行數據為高濃度，低濃度為線性范圍下限的3倍，高濃度為線性范圍上限的70%
圖1-15種膽汁酸基質加標提取離子圖
總結
本方法使用安益譜全自主研發生產的TQ 9100三重四極桿串聯質譜系統，實現了血漿中15種膽汁酸的同時檢測，該方法線性好、準確度高、特異性強，每個樣本分析僅需6分鐘，具有較高的通量，適合臨床檢測分析。
